BIOTEHNOLOGIJA RASPLOĐVANJA:
MOGUĆNOSTI PRIMJENE U STOČARSTVU HRVATSKE

Biotehnologija rasplođivanja podrazumijeva zahvate kojima pod kontroliranim uvjetima vršimo rasplođivanje životinja i utječemo na genetsku selekciju širenjem poželjne genetike prema željenim proizvodnim svojstvima. Ove biotehnologije razvijaju se zadnjih 50 godina prema potrebama i mogućnostima svakog razdoblja. Prva generacija biotehnologije bilo je umjetno osjemenjivanje, druga embriotransfer i srodne tehnologije, treća proizvodnja zametaka in vitro, a četvrta manipulacija genomom uz pomoć transgeneze i kloniranja.

Pohranjivanje sjemena za umjetnu oplodnju

Primjena biotehnologije u rasplođivanju životinja omogućava:

1. genetski napredak stada dobivanjem velikog broja potomaka od najkvalitetnih životinja,
   
2. međunarodni transport i trgovinu zamrznutim zamecima te tako smanjuje rizik prenošenja zaraznih bolesti jer više nije potreban transport živih životinja,
   
3. povećava ponudu visokokvalitetne stoke,
   
4. omogućava aplikaciju drugih tehnologija koje imaju dodatne primjene, kao npr. seksiranje i bližnjenje zametaka, genetske pretrage, seksiranje sperme, proizvodnja transgene stoke i drugo.

Ovi biotehnološki zahvati zahtijevaju sofisticiranu opremu i specijalnu obuku te su stoga skupi za široku primjenu, ali je njihov učinak na odabranoj stoci velik i brz. Uglavnom svi koji rade u ovom području slažu se da je vrlo važno što brže prenijeti genom od matičnih stada u proizvodne jedinice.

U okviru projekta Ministarstva znanosti i tehnologije RH "Proizvodnja in vitro goveđih zametaka" postavljen je standardni protokol za dozrijevanje, oplodnju i uzgoj zametaka in vitro. Također je osnovan Laboratorij za asistiranu reprodukciju životinja pri Klinici za porodništvo i reprodukciju Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu, a u suradnji sa stručnjacima Centra za reprodukciju u stočarstvu Hrvatske d.o.o. Zameci proizvedeni u našem laboratoriju zadovoljavaju kriterije za embriotransfer. U radu je iznesen kratki prikaz prednosti primjena biotehnoloških metoda u uzgoju životinja te su predložene moguće primjene u našim uvjetima.

Biotehnologija rasplođivanja

Primjena reproduktivnih biotehnologija ima dugoročan učinak u stočarstvu. Proizvodna svojstva ovise o genotipu, utjecajima okoline i njihovoj interakciji. Iako se utjecaji okoline mogu kontrolirati tako da budu najpovoljniji, genotip je ključni faktor, a ujedno i razlog zašto upravljanje rasplođivanjem igra veliku ulogu u genetskom napretku stada. U kontroli rasplođivanja koriste se razne metode, od kojih su neke na niskoj tehnološkoj razini i uglavnom se odnose na različite uzgojne odluke, kao što su određivanje dobi za prvo parenje, odabir pasmine krava za određenu proizvodnju, kontrola međutelidbenog razdoblja i dijagnostika graviditeta. Kao nadogradnja ovim uzgojnim metodama razvijene su biotehnološke metode koje imaju učinak na pojedinačnoj, odabranoj životinji (Gordon, 1996.). Biotehnologija rasplođivanja (engl: ART = assisted reproductive technologies) podrazumijeva zahvate kojima pod kontroliranim uvjetima vršimo rasplođivanje životinja i utječemo na genetsku selekciju širenjem poželjne genetike prema željenim proizvodnim svojstvima. Ove biotehnologije razvijaju se zadnjih 50 godina prema potrebama i mogućnostima svakog razdoblja. Prva generacija biotehnoloških metoda bila je umjetno osjemenjivanje, druga generacija embriotransfer, treća proizvodnja zametaka in vitro i srodne tehnologije, a četvrta manipulacija genomom uz pomoć transgeneze.

Kada se razmatraju moguće primjene važno je razlikovati genetske promjene prvog stupnja koje se uglavnom odnose na matična stada od onih koje se postižu kasnije, diseminacijom u proizvodnim jedinicama (Wilmut i sur., 1992.). Genetski napredak ovisi o četiri važna faktora: genetska varijacija određuje razinu genetskog napredka (prvi faktor), a koji također ovisi i o preciznosti kojom vršimo selekciju (drugi faktor), intenzitetu kojim radimo selekciju (treći faktor) i o generacijiskom intervalu (četvrti faktor). Svaka vrsta ima svoju optimalnu ravnotežu koja ovisi o nasljeđivanju određenog svojstva kojega želimo poboljšati, o razini i brzini rasplođivanja te o raspoloživoj tehnologiji kojom možemo promjeniti tu razinu i naravno o ekonomskom faktoru (Wilmut i sur., 1992.).

Inbreeding (razmnožavanje životinja u srodstvu) se ne može izbjeći u potpunosti u stočarstvu te su populacije u selekciji uvijek u opasnosti od tog procesa, stoga je cilj stočara postići maksimalni dobitak, ali pritom voditi brigu o inbreedingu.

Namjera ovog preglednog rada je razmotriti primjenu biotehnologije rasplođivanja u svijetu te mogućnosti i ograničenja u nas.

Prezentacija umjetnog osjemenjivanja prilikom Kongresa
Međunarodnog Udružanje Studenata Veterine u Južnoafričkoj republici, 2001.

2. Embriotransfer (ET) pripada drugoj generaciji biotehnologija kojima se utječe na povećanje rasplodnih potencijala najkvalitetnijih ženskih životinja. MOET (multipla ovulacija i embriotransfer) je sazrijela i stabilna biotehnološka metoda čiji su protokoli gotovo isti već 20 godina, a rezultati superovulacije jamče u prosjeku 5 zametaka po kravi davateljici po ispiranju (Hahn, 1992; Hasler, 1992, Armstrong, 1993). U 1994. godini u Europi su isprane maternice 22.557 superovuliranih krava (Heyman, 1995). Godine 1998 ukupni broj davateljica se povećao na 25.744 te je presađeno ukupno 120.360 zametaka (Thibier, 1999). Zanimljiv je podatak da je 1998. godine u svijetu presađeno 441.295 zametaka, a taj broj i podatci sakupljeni tijekom osam godina pokazuju da se ova biotehnologija primjenjuje u sve širem obimu. Podaci pokazuju da se otprilike polovica zametaka od ovog broja presadi u svježem, a polovica u zamrznuto-odmrznutom stanju. Ovaj izbalansirani omjer pokazuje neke od prednosti ove tehnologije, kao što je fleksibilnost i prilagodljivost zahtjevima različitih tržišta. Tehnologija zamrzavanja zametaka je također sazrijela i stručnjaci se pouzdaju u njezinu primjenu za komercijalne svrhe. Postotak bređosti nakon transfera svježih zametaka iznosi 61%, a zamrznutih 60% (Thibier, 1999.). Također ima podataka o međunarodnom prometu zametaka koji iznosi oko 30.000 godišnje.

Ove tehnologije ne primjenjuju se samo u goveda: ima podataka i o drugim vrstama: u 1998. godini presađeno je više od 15.000 ovčijih, 2.500 jarećih, 1.000 srnećih, 2.700 konjskih i 2.300 svinjskih zametaka u svježem ili odmrznutom stanju (Thibier, 1999.). Iako još nema pouzdanih podataka, ove biotehnološke metode primjenjuju se i u drugih vrsta, uključujući i divljač. Taj porast aktivnosti u embriotransferu, koji se bilježi u cijelome svijetu, simptom je globalizacije, ne samo u tehnološkim trendovima, nego i u potrebi za riješenjem sličnih problema u proizvodnji s kojima se susreću stočari u cijelome svijetu.

Ima nekoliko raz primjena embriotransfera: proizvodnja više potomaka od najboljih krava (MOET programi), bližnjenje, dobivanje potomstva od sekundarno jalovih krava, međunarodna trgovina zamecima te očuvanje ugroženih pasmina i vrsta. Kombinacijom ET sa učinkovitom i jeftinom kontrolom estrusa može se u istom stadu proizvoditi rasplodne bikove namijenjeje za U.O., bikove za tov i bikovske majke (Betteridge i Rieger, 1993.).

U mnogim naprednim zemljama embriotransfer se koristi za proizvodnju mladih bikova namjerenih za centre U.O. (Morstin i sur., 1994.), iskorištavajući genom najboljih bikova i krava. Betteridge (1995.) navodi da je 27,5% bikovskih majki i 44% najkvalitetnijih bikova u SAD-u dobiveno postupkom embriotransfera.

MOET programi u kombinaciji s U.O. krave davateljice je tehnologija kojom se postiže brže genetsko poboljšanje stada nego samo s U.O. Programi MOET-a primjenjuju se u nukleusnim stadima gdje se vrši superovulacija davateljica. Kod mliječnih krava MOET se može primijeniti prije nego uđu u proizvodnju ili poslije prve laktacije. Genetska dobit je 30 do 50% brža na junicama u proizvodnji bikova i potencijalnim bikovskim majkama (Gordon, 1996.).

MOET se u državama u razvoju smatra još učinkovitijim nego u razvijenim državama. Zametci su jeftinji za transport nego odrasle krave, a rizik zaraza također je manji. Presađeni u domaće primateljice, ET zametci imaju prednosti nad odraslim životinjama, jer primaju pasivni imunitet preko kolostruma, a imaju fiziološku i prirodnu adaptaciju novoj sredini (Gordon, 1996.).

Ova biotehnologija ima i svojih mana: varijacije u brojevima nakon superovulacije još uvjek postoje, a to utječe na brže širenje genoma nekih plotkinja, negoli od drugih. Pored toga širenje genoma jednog matičnog stada ima efekt na inbreeding populacije, no genetski se napredak ipak postigne.

3. Proizvodnja zametaka in vitro predstavlja treću generaciju biotehnologije. Nakon rođenja prvog teleta dobivenog oplodnjom in vitro jajnih stanica dozrelih in vivo (Brackett i sur., 1982.) “in vitro” era je brzo napredovala, no tek je s uspješnom primjenom čitavog in vitro postupka, odnosno dozrijevanja (IVM), oplodnje (IVF) te uzgoja in vitro (IVC) do stadija morule/blastociste (Lu i sur., 1987.), omogućen konačni proboj in vitro tehnologije. Razvoj ove biotehnologije ima fantastične potencijale kako za temeljna istraživanja tako i za njihovu primjenu u komercijalnom uzgoju stoke i genetski napredak stada. Osim toga omogućuje razvoj drugih biotehnologija kao što su kloniranje i proizvodnja transgenih životinja.

Shema oplodnje In Vitro

Među najznačajnijim primjenama IVP u govedarstvu su: zaobilaženje nepredvidivog superovulacijskog odgovora i nekih poremećaja u genitalnom traktu davateljica (Sirard, 1989.), proizvodnja zametaka iz jajnih stanica dobivenih ultrazvučnom punkcijom jajnika visokovrijednih krava (OPU) (Kruip i sur, 1991.), kontrola širenja zaraznih bolesti (Stringfellow i Givens, 2000.), skraćenje generacijskog intervala proizvodnjom zametaka od ženske teladi prije puberteta (Duby i sur., 1996.), jeftina masovna proizvodnja zametaka iz klaoničkog materijala za tranfer u mliječne krave čija telad ide u tov (Van Soom i de Kruif, 1996.), proizvodnja blizanaca u tovnih životinja (Pugh i sur., 1994.), određivanje plodnosti bikova koji se koriste za UO (Marquant-Le Guienne i sur., 1990.), ubrzavanje progenog testiranja bikova, proizvodnja transgenetskih životinja injekcijom gena u pronuklearnom stadiju i kloniranje (Prather i First, 1990.).

Četverostanični embrio

Razvoj tehnike za polučivanje jajnih stanica iz živućih davateljica uz pomoć OPU omogućio je primjenu IVP za genetsku selekciju (Pieterse i sur, 1991.). Polučivanje jajnih stanica od živih visoko kvalitetnih krava, bez ikakve posljedice za davateljicu, i oplodnja in vitro s odgovarajućim bikom za proizvodnju teladi s pedigreom je jasna prednost. Ključni aspekti su: mogućnost dobivanja jajnih stanica od visokokvalitetnih krava i oplodnja sa spermom različitih bikova, tako da se dobije jedan faktorijalni dizajn kojim se ne povećava toliko inbreeding. Za razliku od MOET-a koji proizvodi braću (ista majka, isti otac), uz pomoć IVP se od jedne majke može proizvesti više potomaka od različitih bikova (polu-braće); tako se postiže brži genetski napredak uz isti inbreeding (Woolliams, 1989.). Učinkovitost ove faktorijalne sheme je najveća kad je broj krava i bikova podjednak, tako da svaka krava ima potomke sa različitim bikovima (Woolliams i Wilmut, 1989). Za navedene primjene potrebne su dobro definirane, uspješne metodologije, koje jamče dobre i stabilne rezultate, barem što se same procedure tiče, jer za biološki materijal nikada nema garancije. Statistički podaci IETS-a pokazuju da u 1998. godini 31.327 IVP zametaka presađeno u primateljice, najveći dio u Evropi (14.113), a otprilike polovica su bili zamrznuti-odmrznuti zametci (Thibier, 1999). Postotak gravidnosti nakon transfera svježih IVP zametaka kreće se od 50 do 60%, a kod transfera zamrznutih/odmrznutih zametaka taj je postotak znatno niži te ne prelazi 35% (Gordon, 1996.). Mnoga istraživanja pokazala su da se IVP zameci po svojim morfološkim i funkcionalnim značajkama razlikuju od onih dobivenih in vivo. To se odnosi na razlike u procesu brazdanja, morfologiju embrionalne zametne mase, nižu metaboličku aktivnost embrionalnih stanica, osjetljivost na sniženu temperaturu te preživljavanje nakon konvencionalnih postupaka zamrzavanja/odmrzavanja (Wagtendonk-de Leeuw i sur., 2000.).

Proizvodnja velikog broja ET i IVP zametaka i mogućnosti međunarodne trgovine, postavila je pitanje regulacije zakonskih normativa. Stoga je Međunarodno Društvo za Embriotransfer (IETS) donijelo propise vezane uz sanitarnu kontrolu poizvodnje zametaka da bi se smanjio rizik mogućeg prijenosa zaraznih bolesti (Stringfellow i Seidel, 1998.). Provedena su mnoga istraživanja da bi se dokazalo da višekratno "pranje" zametaka, tretman tripsinom i dodatak antibiotika u medije osiguravaju učinkovito uklanjanje ili inaktivaciju infektivnih agensa (Stringfellow i Givens, 2000.). Stoga je neophodno u standardni protokol za proizvodnju IVP zametaka, bilo u komercijalne ili istraživačke svrhe, uvrstiti i metode koje propisuje IETS.

4. Učinkovita proizvodnja zametaka in vitro preduvjet je za primjenu biotehnologije četvrte generacije: kloniranja, transgeneze, određivanja spola potomstva i dr. Visoko tehnološki potezi su najučinkovitiji u ekonomskom smislu: njima se kontrolira bližnjenje, spol teladi i mogu se klonirati odrasle životinje. Najnaprednjim biotehnologijama smatramo one gdje se izravno manipulira genomom životinja da proizvedu nešto poželjno ili da odstranimo nepoželjno. Uglavnom svi koji rade u ovom području slažu se da je vrlo važno prenijeti što brže genom od nukleusnih stada u proizvodne jedinice.

12 identičnih

U ovom okviru može se razmatrati kakav se dodatni genetski napredak može dobiti primjenom drugih biotehnologija kao što su: seksiranje, multiplikacija genoma jednog zametka bližnjenjem ili transferom jezgre (kloniranje). U seksiranju su razvijene dvije metode: jedna vrši pretragu spola potomka putem determinacije DNK specifičnih kromosoma Y (Thibier i Nibart, 1995.), druga odvaja spermatozoide koje nose Y odnosno X kromosom tako da se ta sperma može koristiti u oplodnji in vitro ili čak za UO (Johnson i Welch, 1999.). Ovim se postupcima može izabrati spol potomaka i tako iskoristiti u potpunosti potencijal proizvedene mladunčadi, uglavnom za izmjenu u matičnom stadu ili za bikovske majke (Hohenboken, 1999.).

Za multipliciranje genoma jedne životinje (ili zametka) koriste se dvije metode: bližnjenje (splitting) ili transfer jezgre (nuclear transfer). Bližnjenjem se može proizvesti do 2 teladi od jednog zametka, te se koristi komercijalno i poboljšava rezultate embriotransfera (Kippax i sur., 1991.) pa je moguće dobiti do 110% teladi više nego samo MOET-om. Primjenom tehnike transfera jezgre taj se broj može uvelike povećati, iako ova tehnologija još nije usavršena. Ova biotehnologija omogućava proizvodnju identičnih životinja (kloniranje) te ima specifičnu primjenu samo za određene proizvodnje i to uglavnom uz druge manipulacije genomom (transgenezu) s aplikacijom u farmaceutskoj industriji (Turner, 1999.; Piedrahita, 2000.).

Za široku komercijalnu primjenu, najveći utjecaj u embriobiotehnologijama ima ekonomski isplatliv rutinski embriotransfer, a zamrzavanje i pohranjivanje zametaka, te odmrzavanje na farmi i direktni transfer u primateljice primjenjuje se rutinski (Voelkel i Hu. 1992.).

U mliječnih krava mogu se proizvesti tovni blizanci od jajnih stanica iz jajnika sakupljenih na klaonici i osjemenjenih in vitro sa mesnatim bikom, tako da se može garantirati da ta telad ima barem 75% tovne genetike, a proizvedeni su na najjeftiniji način.

Sve tehnologije koje šire poželjni genom su primjenjive u proizvodnim jedinicama gdje se životinje koriste isključivo za proizvodnju, a rasplod u matičnim stadima. To se može primjeniti od MOET-a do kloniranja. Genetske prednosti, ocijenjene performanse testovima, služe za odabir vrhunskih proizvodnih životinja, prema kriterijima industrije. Testovi uključuju također kriterije za uzgoj tih životinja, kao npr. aklimatizacija na određenu okolinu, otpornost na određene bolesti, temperament i drugo. Moguće je također proizvesti križance koristeći prednosti koja pruža heterosis efekt. Tako uzgojene jedinice biti će u proizvodnom smislu bolje nego matično stado.

Ima nekoliko stajališta u svezi primjene ovih biotehnoloških metoda: ekonomski faktori su bitni, ali i sama genetska manipulacija. Mora se shvatiti da u genetskom napretku postoji jedan put te da korak naprijed u nekom određenom pravcu, teško možemo vratiti unatrag. Replikacija poželjnih gena u populaciji ima za posljedicu odstranjivanje nepoželjnih gena, ali i u tom se sklopu izgube drugi geni koji se izgube i tako osiromašuje ukupni genetski fond. Uglavnom je mišljenje da se prije svakog pomaka u genetici mora modelirati rezultat. Zamrzavanje sperme i zametaka, jajnih stanica i biopsija jajnika su sredstva za očuvanje genoma i sredstvo protiv katastrofalnih promjena. Sve se ove promjene izvode u sporazumu sa genetičarima koji koriste genetske markere za selekciju (Wilmut i sur., 1992). Genetska manipulacija je jedina postojeća mogućnost da se stvori nova genetska varijabilnost u jednoj vrsti izvan prirodne mutacije, pri čemu se broj već postojećeg povećava selekcijom ili se ex novo proizvodi nešto nepostojeće. Genetske mape i markeri za selekciju pomažu da se poželjni geni uvode u jednu populaciju preko introgresije od neke druge populacije. Selekcija preko ovih genetskih indikatora primjenom reproduktivnih biotehnologija ima veliku prednost u genetskom napretku jer povećava preciznost selekcije, smanjuje generacijiske intervale i povećava intenzitet selekcije: sve se to može provesti u dopustivoj granici inbreedinga (Wilmut i sur., 1992.).

Primjena biotehnologije rasplođivanja u RH

U Republici Hrvatskoj kompletni MOET postupak uveden je u našu veterinarsku medicinu u okviru projekta Ministarstva znanosti i tehnologije (MZT) RH "Embriotransfer u goveda" (1993.-1997.), tijekom kojeg su istraženi različiti postupci superovulacije davateljica (Makek i sur., 1994.a), smrzavanja goveđih zametaka te transfera u sinkronizirane primateljice (Makek i sur., 1994.b; Makek i sur., 1994.c). Kao rezultat suradnje stručnjaka Klinike za porodništvo i reprodukciju Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu i Centra za reprodukciju u stočarstvu Hrvatske d.o.o. rođeno je prvo tele nakon uspješnog embriotransfera u rujnu 1995. godine (Makek i sur., 1996.)

U okviru projekta MZT "Proizvodnja in vitro goveđih zametaka" (1997.-) postavljen je standardni protokol za dozrijevanje, oplodnju i uzgoj zametaka in vitro te postavljeni temelji za mogućnosti primjene i iskorištavanja prednosti ove biotehnologije i u našoj stočarskoj proizvodnji. U suradnji stručnjaka gore navedene Klinike i Centra za reprodukciju u stočarstvu Hrvatske d.o.o. osnovan je Laboratorij za asistiranu reprodukciju životinja. Današnje mogućnosti našeg Laboratorija obuhvaćaju: MOET, IVP iz klaoničkog materijala i OPU superovularinih ili krava u ciklusu te embriotransfer u primateljice, krioprezervaciju zametaka te ranu ultrazvučnu dijagnostiku graviditeta u krava primateljica. Pored toga istražujemo i primjenu drugih biotehnologija i mogućnosti njihove primjene u drugih životinjskih vrsta.

Od 1995. godine uveden je u nastavni program na Klinici za porodništvo i reprodukciju Veterinarskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu seminar "Embriotransfer i biotehnologija rasplođivanja", koji se se održava u VIII. semestru dodiplomske nastave, kako bi se budući veterinari upoznali i pripremili za primjenu ovih novih biotehnologija u našoj zemlji.

Da bi ove biotehnološke metode postale primjenjive u našim uvjetima i da bi mogli iskoristiti njihove prednosti u genetskom napretku stada, neophodo je odrediti željene proizvodne ciljeve te uskladiti progame i rad različitih institucija uključenih u stočarsku proizvodnju i selekciju te veterinarske službe. Primjena navedenih biotehnoloških metoda nužna je za uključivanje naše stočarske proizvodnje u međunarodne tokove, pogotovo nakon ostvarenja mogućnosti ulaska u WTO.